Răspândirea virusurilor albinelor care conțin ARN -acid ribonucleic- la albinele Apis Mellifera în anumite regiuni ale Rusiei

              În stupinele din unele regiuni ale Rusiei, o distribuție largă de ARN care conține virusurile albinelor a fost găsita la albinele Apis mellifera prin metoda RT-PCR. Virusurile albinelor identificate care conțin ARN se răspândesc concomitent cu invazia acarianului  Varroa destructor si cauzeaza moartea albinelor, care provoacă daune economice apiculturii. 

Prezența virusurilor albinelor DWV și ABPV a fost detectata în mostrele de Varroa distructor. Un grad ridicat de infecție cu ARN care conține virusi (BQCV, DWV SBV, ABPV, CBPV și KBV) a fost stabilit, în medie, cel puţin 50% pentru coloniile de albine infestate cu acarieni. În coloniile de albine studiate, a fost gasita o infectie mixta cu prezența a doi până la șase viruși simultan.  Fragmentele amplificate rezultate ale virusurilor BQCV, DWV și SBV au fost secvențiate folosind RT-PCR și înregistrate în Genbank.

Cuvinte cheie: virusuri ale albinelor care conțin ARN; albina; Apis mellifera; Varroa destructor; RT-PCR.

               Pentru populațiile de albine, există în prezent factori de risc de îmbolnăvire (de mediu și biogeni) care afectează în mod egal toate speciile de insecte polenizatoare, și nu doar albinele sălbatice [1]. Pentru populațiile de albine domestice, datele privind riscurile biogene și infecția cu virusuri sunt puține. În laboratorul nostru, pentru prima dată, folosind metode genetice moleculare (RT-PCR), a fost confirmată infecția albinelor cu virusuri care conțin ARN pe teritoriul Rusiei și, pentru prima dată, un fragment din secvența de nucleotide a virusului aripilor deformate (DWV) a fost secvențiat și a fost efectuată analiza filogenetică a acestuia [2, 3]. Virusul puietului in sac (SBV) a fost studiat în Rusia [4]. A fost efectuat un studiu al infecției cu virus ARN a albinelor în stupine individuale [5]. Scopul acestui studiu a fost de a studia răspândirea virusurilor albinelor care conțin ARN în unele regiuni ale Rusiei, folosind metode genetice moleculare.

Materiale si metode

              Albine vii pentru izolarea ARN și RT-PCR au fost selectate din stupine (Tabelul 1, Fig. 1) în 2009-2012 din stupi infectați cu acarieni sau cu semne vizibile de infecție sau pierdere de albine. Varroatoza cu un grad de invazie, începând de la 3%, a fost determinată printr-o metodă modificată (îndepărtarea căpușei cu apă fierbinte și săpun în loc de zahăr pudră) [6].

Pool-ul total de ARN a fost izolat din 50 μg din regiunea toracică a albinei folosind kitul Trizol DNA Prep, iar transcripția inversă a fost efectuată folosind kitul GenPack RT-PCR Core (Izogen, Rusia) cu cantitatea de enzimă 50 U/ reacţie. Pentru PCR a fost utilizată trusa de bază GenePack RT PCR (Izogen, Rusia). Analiza PCR a fost efectuată conform metodei modificate propuse anterior utilizand primeri specifici virusurilor: DWV (virusul aripilor deformate), ABPV (virusul paraliziei acute), CBPV (virusul paraliziei cronice), KBV (virusul Kashmir), SBV (virusul puietului in sac). ), BQCV (virusul celulelor reginei negre) ) [7, 8]. Pentru o detectare mai fiabilă a virusilor DWV și ABPV, perechi suplimentare de primeri ABPV (varianta 2) [9] și DWV (varianta 2) [10] au fost utilizate. Secvențele de primerii oligonucleotidici au fost sintetizați de Syntol (Rusia) (Tabel2).

             Temperatura de recoacere a primerului a fost redusă cu 2-3 grade datorită utilizării unui kit PCR liofilizat (Izogen, Rusia). Metoda PCR a fost efectuată pe un termociclator MyCycler (Bio-Rad, SUA). Produsele de amplificare au fost separate în gel de agaroză 1,5-2% într-o cameră electroforetică SubCell GT System (Bio-Rad, SUA) folosind tampon TBE pH 8,0. Probele au fost aplicate pe gel folosind colorant portocaliu (Fermentas, Letonia). DNA GeneRuler 50bp DNA Ladder (Fermentas, Letonia) a fost folosit ca marker de greutate moleculară. Vizualizarea ADN-ului a fost efectuată folosind soluție de bromură de etidiu 0,5% (Sigma, SUA). Rezultatele obţinute au fost înregistrate folosind sistemul de documentare a gelului Gel Pro 3.1 (https://gel-pro-analyzer.software.informer.com). Izolarea amplificatului de ADN din gelul de agaroză a fost efectuată într-un cartuş de eluatie cu gel ADN (Izogen, Rusia) urmată de precipitare cu etanol 70% în prezenţa a 1M CH3COON  (Merck, Germania).

               După uscare, preparatul rezultat a fost dizolvat în tampon TE și utilizat într-o cantitate de 1-2 ng pentru secvențiere. Secvențierea conform metodei Sanger a fost efectuată pe un secvențietor automat 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies, SUA). Prelucrarea statistică a rezultatelor a fost efectuată cu ajutorul programelor de calculator: "GenAlEx6" [11].

Rezultate si discutii

               Au fost prelevate probe de albine SK, MA, MIS, MDO și TU din colonii slăbite afectate de varroatoză. În perioada 2011-2012, în raioanele Kiznersky, Vavozhsky, Yukamensky (UD3-UD5) din Republica Udmurtia, conform observațiilor veterinare, nu au existat manifestări clinice ale infecțiilor și nicio infestare cu căpușe. În districtul Zavyalovsky, a fost dezvăluit un grad ridicat de invazie a căpușelor de până la 30%, în satul Luke, gradul de infestare provocat de capuse a fost mai mare de 15%. În Yakshur, districtul Bodinsky, a fost observat un grad mediu de infestare cu căpușe (până la 5%). Albinele se târau pe pământ lângă crestătură, aveau intestinele supraaglomerate, multe albine aveau aripile atrofiate. În districtul Vavozhsky, a existat o slăbire a familiilor fără semne clinice ale bolii.

               Fragmentele de virus detectate au avut o lungime corespunzătoare datelor calculate și publicate [7-9]. Folosind primerii ABPV (2) [10], nu au fost detectate probe infectate. Corespondența fragmentului amplificat pe ținta a fost confirmată prin secvențierea de amplificare. Secvențele de nucleotide obținute au fost înregistrate în Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank): DWV (KF274666.1, GQ422786.1, JX993278.2, KC138852.2, KC138854.1), BQCV (KC138853.2) și KF274668.1, KF274667.1, KC020674.2, KC020673.2. Spectrul de virusuri detectat în probe de albine și acarieni, precum și frecvențele combinațiilor detectate cu infecție simultană sunt prezentate în Fig. 2. 

              Infecția populațiilor domestice de albinele cu virusurile care conțin ARN respectiv DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV și CBPV a fost realizata; cele mai frecvente virusuri sunt DWV și SBV. Din toate probele studiate, doar unul - în districtul Kiznersky (UD4) - nu contine infecție virală. În toate celelalte probe, rata de infecție a fost de cel puțin 33,3 % din numărul total de colonii studiate în stupină. Când se utilizează primeri ABPV (2) pentru a detecta ABPV, nu a fost detectat niciun virus in nici una din probe. În probele MA, MDO, MIS, AB, MDO și SK, virusul DWV a fost detectat numai folosind prima variantă a primerilor (Tabelul 2). Utilizarea primerilor DWV (2) [9] nu a oferit o detecție mai completă a DWV. 

             La analiza infecțiilor virale multiple, s-a constatat că toate cele 6 virusuri care conțin ARN studiati au fost identificați în proba MIS de albine. În proba MA s-a stabilit prezența a 5 virusuri în același timp, si in proba SK au fost detectati 3 virusuri simultan.

           În probele de albine de pe teritoriul Udmurtiei nu s-au găsit colonii în care albinele au fost infectate cu mai mult de 4 virusuri simultan (Fig. 3, Tabelele 3 și 4). Cele mai comune combinații de viruși sunt DWV-ABPV-CBPV-SBV-BQCV, precum și DWV ABPV, ABPV-CBPV-KBV, DWV-APBV-KBV și APBV-CBPVSBV. Dat fiind faptul ca virusurile enumerate au un efect letal, este evident ca infectiile virale multiple sunt foarte periculoase pentru viata coloniei de albine.

          La acarieni, virusul DWV este detectat la fel de des atunci când se utilizează ambele variante de primer. Simultan cu DWV, a fost detectat virusul ABPV. În același timp, virusul ABPV nu a fost detectat în eșantionul de căpușe UD-VD colectat colectat de pe rama.

Fig. 1. Schema punctelor de colectare a probelor de albine din Udmurtia pentru detectarea virusurilor albinelor care conțin ARN.

           Cele mai frecvente virusuri sunt DWV (apariția medie în coloniile de albine 45%) și SBV (43%), cu o frecvență mai mică - virusurile ABPV (15%), BQCV (12%), CBPV (11%) și KBV (5,4%). Detectarea DWV folosind cea de-a doua variantă a primerilor DWV (2) s-a dovedit a fi mai puțin eficientă. În probele MA, TU, MIS, AB, MDO, SK și în probele Udmurt UD4 și UD5, virusul DWV nu a fost detectat folosind a doua variantă a primerilor DWV (2) (Tabelul 2), în timp ce în probele UD1 , UD2 cu el, a fost detectat virusul DWV. Totuși, în probele UD1, acesta a fost găsit nu în toate probele, ci în eșantionul UD2, în aceeași măsură.

           Datele privind răspândirea infecțiilor virale ale albinelor în Europa indică [8, 9, 12] că până la 20% din infecțiile virale ale albinelor au fost mixte.

           Conform rezultatelor studiului nostru, infecțiile mixte au fost oarecum mai puțin frecvente (detecția a două viruși simultan în familiile din regiunea Moscovei, despre care se știe că sunt infectate cu o căpușă, a atins o medie de 33,6%, iar în stupinele din Austria - 37%) [8].

            Cel mai des a fost observată infecția cu două virusuri, mai rar cu 5 și 3 virusuri, iar infecția cu 4 și 6 virusuri a fost cel mai rar observată. Din datele obținute rezultă că nu toate combinațiile de virusuri cu o infecție combinativă simultană apar în coloniile de albine cu aceeași frecvență. Poate că există motive care determină distribuția predominantă a anumitor combinații, sau acestea sunt combinații aleatorii. Conform literaturii despre infecțiile virale ale albinelor în Europa, în mai multe studii, similare studiului nostru, s-a constatat că albinele sunt infectate cu mai multe viruși simultan [8, 9, 13].

            Anterior, infecția cu V. destructor s-a dovedit a fi un factor predispozant pentru transmiterea virală [14]. Conform literaturii de specialitate, infecția cu DWV se poate răspândi și prin parazitismul căpușelor pe pupă [15]. Conform datelor noastre, prezența unei infecții virale a fost descoperita și în coloniile de albine în care a fost prezentă infestarea cu acarianul V. destructor. A fost stabilită prezența infecției cu virusuri care conțin ARN (DVW și APBV) la căpușe, ceea ce confirmă posibilitatea transmiterii unei infecții virale la albine de la căpușe. Restul spectrului de virusuri nu a fost detectat în căpușe, ceea ce se poate datora unei mostre prea mica de căpușe Varroa destructor.

Fig. 2 Distribuția virusurilor albinelor care conțin ARN în probele studiate de albine și acarieni. Axa y arată frecvența de detectare a virusurilor care conțin ARN.

             Astfel, folosind RT-PCR în probe de populații de albine din rasa Central Rusă (pe teritoriul Udmurtia, Teritoriul Stavropol, regiunile Moscova și Tula), rasa Carpatică (Adygea și regiunea Moscova) și Carnica (Abhazia), a fost detectata prezența ARN-ului -conținând virusuri ai albinelor. S-a stabilit o infecție a albinelor cu două virusuri în același timp (în medie de la 33,6%) și mai mult de două virusuri (de la 23,9%). A fost stabilita prezența virusurilor albinelor care conțin ARN (DWV și ABPV) în acarienii Varroa destructor. Metodele de diagnostic molecular reprezintă un instrument eficient pentru sacrificarea anuală a coloniilor de albine infectate cu virusuri, ca parte a activităților veterinare, pentru a preveni răspândirea în continuare a bolilor virale și moartea populațiilor de albine.

Fig 3 Frecvențele combinațiilor detectate cu infecția simultană a unei colonii de albine cu mai multe virusuri care conțin ARN.

In figura 3, abscisa arată multiplicitatea infecției virale observată în infecția mixtă, ordonata - arată frecvența combinațiilor individuale.

Mulțumiri. Autorii îi sunt recunoscători lui Maslennikov I.V. Kolbina L.M., Korolev A.V., Maslennikova V.I., Klochko R.T. și alți apicultori pentru ajutorul acordat în colectarea de mostre de albine și acarieni. Lucrarea s-a desfășurat în grupul de imunogenetică a populației din cadrul departamentului de genetică a populației a Institutului de Genetică Generală. N.I. Vavilov RAS.

Finanțare. Lucrarea a fost susținută de grantul RFBR 08-04-13740-ofi_ts "Dezvoltarea tehnologiilor ADN pentru certificarea raselor și descendențelor de albine Apis mellifera în Rusia" și contractele de stat ale Ministerului Educației și Științei "Analiza genetică moleculară a biodiversitatea plantelor, animalelor și oamenilor" 14.740.12.0826 (2011-1.4 -501-001) (2011) și "Analiza experimentală, bioinformatică și genogeografică a diversității genomice a oamenilor și animalelor" Nr. 8088 (2012).

Conflict de interese. Autorii declară niciun conflict de interese.

Literatura (p p . 1, 6 - 15 cm. Referinte)

2. Udina I.G., Grishechkin A.E., Kunizheva S.S., Kalashnikov A.E., Uchaeva V.S., Zlobin V.I., Krivtsov N.I. Virus detection wing deformations (DWV) in the honey bee Apis mellifera L. in apiaries in the Moscow region by RT-PCR. Question. virusol. 2010; 55(5):37-9.

3. Udina I.G., Grishechkin A.E., Kalashnikov A.E., Zlobin V.I., Krivtsov N.I. Identification of wing warp virus (DWV) in the honey bee. Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences. 2010; (1): 69-71.

4. Lomakina N.A., Batuev Yu.M. New genotype of sacbrood virus in Apis mellifera bees. Molecules genetics, microbiology and virusol. 2012; (3): 34-40.

5. Kalashnikov A.E., Maslennikov I.V., Kolbina L.M., Udina I.G. Genetic differentiation of honey bee (Apis mellifera L.) populations and spread of RNA-containing bee viruses against the backdrop of Varroa destructor mite epizootic in Udmurtia. Agricultural biology. 2013; (4): 88-92.

Referinte

1. R oulston T.H., Guodell K. The role of resourses and rise in regulating of wild bee populations. Annu. Rev. Entomol. 2011; 56: 293-312. doi: 10.1146/annurev-ento-120709-144802

2. Udina I.G., Grishechkin A.E, Kunizheva S.S., Kalashnikov A.E., Uchaeva V.S., Zlobin V.I., Krivtsov N.I. Detection of deformed wing virus (DWV) in honey bee Apis mellifera L. in the apiary of Moscow region by RT -PCR method. Vopr. virusol. 2010; 55 (5): 37-9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21260995 (in Russian)

3. Udina I.G., Grishechkin A.E., Kalashnikov A.E., Zlobin V.I., Krivtsov N.I. Identification of deformed wing virus (DWV) in honey bee. Vestnik Rossiyskoy akademii sel'skokhozyaystvennykh nauk. 2010; (1): 69-71. (in Russian)

4. L omakina N.F., Batuev Yu.M. New genotype of the sacbrood virus of the honeybee Apis mellifera. Molekul. genetika, mikrobiol. i virusol. 2012; (3): 34-40. doi: 10.3103/S0891416812030068 (in Russian)

5. Kalashnikov A.E., Maslennikov I.V., Kolbina L.M., Udina I.G. Genetic differentiation of populations of honey bee (Apis mellifera L.) and distribution of RN A-containing viruses at the background of epizootia of Varroa destructor on the territory of Udmurtia. Sel'skokhozyaystvennaya biologiya. 2013; (4): 88-92. doi: 10.15389/ agrobiology.2013.4.88eng. doi: 10.15389/agrobiology.2013.4.88rus, https://www.agrobiology.ru/4-2013kalashnikov-eng.html (in Russian)

6. Dietemann V., Nazzi F., Martin S.J., Anderson D.L., Locke B., Delaplane K.S. et al. Standard methods for Varroa research. J. Apicult. Res. 2013; 52 (1): 1-54. https://dx.doi.org/10.3896/IBRA.1.52.1.09

7. Bereneyi O., Bakonyi T., Derakhshifar I., Koglberger H., Topolska G., Ritter W. et al. Phylogenetic analysis of deformed wing virus genotypes from diverse geographic origins indicates recent global distribution of the virus. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73 (11): 3605-11. doi: 10.1128/AEM.00696-07

8. Berenyi O., Bakonyi N., Derakhshifar I., Koglberger H., Nowotny N. Occurrence of six honeybee viruses in diseased Austrian apiaries. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72 (4): 2414-20. doi: 10.1128/ AEM.72.4.2414-2420.2006

9. De Miranda J.R., Cordoni G., Budge G. The acute bee paralysis virus-Kashmir bee virus-Israeli acute paralysis virus complex. J. Invertebr. Pathol. 2010; 103 (1): 30-47. doi: 10.1016/j.jip.2009.06.014

10. Chen Y., Evans J., Feldlaunter K. Horizontal and vertical transmission of viruses in the honeybee Apis mellifera. J. Invertebr. Pathol. 2006; 92 (3): 152-4. doi: 10.1016/j.jip.2006.03.010

11. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update. Bioinformatics. 2012; 28 (19): 2537-9. doi: 10.1093/bioinformatics/ bts460

12. Antunez K., Anido M., Garrido-Bailon E., Botias C., Zunino P., Martinez-Salvador A. et al. Low prevalence of honeybee viruses in Spain during 2006 and 2007. Res. Vet. Sci. 2012; 93 (3): 1441-5. doi: 10.1016/j.rvsc.2012.03.006

13. Antunez K., DeAlessandro B., Corbella E., Zunino P. Detection of chronic bee paralysis virus in Uruguayan honeybee. J. Invertebr. Pathol. 2005; 90: 69-72. doi: 10.1016/j.jip.2005.07.001

14. Chen M., Cui L., Ostiguy N., Cox-Foster D. Intricate transmission routes and interactions between picorna-like viruses (Kashmir bee virus. Sacbrood virus) with the honeybee host and the parasitic Varroa mite. J. Virol. 2005; 86: 2281-9. doi: 10.1099/vir.0.80824-0

15. Gisder S., Genersch E. Deformed wing virus: replication and viral load in mites (Varroa destructor). J. Gen. Virol. 2009; 90: 463-7. doi: 10.1099/vir.0.005579-0

Sursa acetui articol o reprezinta publicatia oficiala pe care o puteti descarca de aici: